CES - Revista Veterinaria Julio - Diciembre 2007 - (Page 16) de la granulosa rodeando completamente al oocito, y morfología intacta. Los CCOs seleccionados fueron lavados en medio Hepes suplementado con 0.2mM piruvato de sodio (Sigma P5280) y 3mg/ml de albúmina sérica bovina fracción V (Sigma A9647). LP 515, que muestra un color rojo. Se realizó fotografía digital (Sony DSC-S85) de las emisiones fluorescentes observadas en los oocitos, las cuales fueron cuantificadas en unidades relativas por su densidad media mediante el programa Scion Image Alpha 4.0.3.2 (Scion Corporation), donde los valores mínimos de densidad correspondieron a la máxima fluorescencia, mientras los valores máximos Maduración in vitro de oocitos de densidad correspondieron a la mínima fluorescencia, Se establecieron dos tratamientos de maduración in vitro por lo cual posteriormente los valores encontrados fueron de oocitos. Para el primer tratamiento, denominado de invertidos, y transformados a valores porcentuales por maduración sin suero, los CCOs fueron incubados en tratarse de unidades relativas, tomando como referencia grupos de 10 por gota de medio de maduración, donde los valores de fluorescencia de los controles positivo cada gota de 50 µl consistió en medio de fluido oviductal (en células de la granulosa) y negativo (en imágenes sin sintético (SOF) suplementado con 1X de medio esencial fluorescencia alguna), los cuales correspondieron a los mínimo con aminoácidos no esenciales (MEMneaa, valores de 100% y 0%, respectivamente. MEM Eagle Sigma M0268), 1X de medio esencial mínimo con aminoácidos esenciales (MEMeaa, BME Fertilización y cultivo in vitro Sigma B6766), 0.33 mM de piruvato de sodio, 1.5 mM de D-(+)-glucosa (Sigma G7021), 8 mg/ml de albúmina Los oocitos madurados en medios con y sin suero, fueron sérica bovina libre de ácidos grasos (BSA FAF, Sigma lavados en Hepes suplementado y puestos en medio de A6003), LH (10µg/ml), FSH (10µg/ml), y 10µl/ml de fertilización preincubado, donde cada gota de 50 µl fue solución antibiótica (100X ICN 1674046, penicilina constituida por medio FERT-TL con 1.0 µM de piruvato 10.000UI/ml; estreptomicina 10mg/ml; anfotericina B de sodio, 6mg/ml de BSA-FAF y 2X de MEMneaa, y fue 25mg/ml). Las gotas fueron cubiertas con aceite mineral suplementada al momento de la inseminación con 2µl de (Sigma M8410) y preincubadas bajo condiciones de PHE (penicilamina 2mM, epinefrina 250 mM, hipotaurina maduración por un mínimo de 3 h (38.5ºC, 5% CO2, con 1mM) y 2µl de heparina (10µg/ml). Posteriormente los 100% de humedad), luego los CCOs fueron transferidos oocitos fueron inseminados con semen criopreservado el a las gotas, para ser incubados por 24 h (38.5ºC, 5% CO2 cual se descongeló a 37ºC y fue seleccionado mediante con 100% de humedad). Para el segundo tratamiento, la técnica de gradiente doble de percoll, y diluido a denominado de maduración con suero, los CCOs fueron una concentración de 1 millón de espermatozoides incubados igualmente en grupos de 10 por gota de medio, por mililitro. Se permitió la interacción entre oocitos donde cada gota de 50 µl de medio consistió en SOF y espermatozoides durante 18 horas a 38.5ºC, 5% CO2 suplementado de igual manera que el medio sin suero, y humedad máxima. A las 18 horas post-inseminación más 10% de suero fetal bovino (SFB, Gibco BRL). Las (hpi) los presuntos cigotos fueron denudados de las gotas fueron cultivadas mediante el mismo procedimiento células del cúmulus y cultivados durante 72 horas en del tratamiento sin suero. gotas de 50µl de medio de cultivo constituido por SOF suplementado con 1X de MEMneaa, 1X de MEMeaa, Determinación de la actividad mitocondrial de oocitos 8mg/ml de BSA-FAF, 0.33mM de piruvato de sodio, 1.5 Un total de 40 oocitos (repeticiones) para cada tratamiento mM de D-(+)-glucosa, 0.1 mM de EDTA (Sigma E6758), de maduración in vitro (libre de suero y suplementado 0.1mM de taurina (Sigma T8691) y 10µl/ml de solución con suero), fueron cuantificados y evaluados para su antibiótica (100X ICN 1674046, penicilina, 10.000UI/ porcentaje de fluorescencia. Sobre los oocitos madurados ml; estreptomicina 10mg/ml; anfotericina B 25mg/ml). se utilizó el fluorocromo reportero de potencial de Se evaluaron las tasas de desarrollo obtenidas hasta membrana interna mitocondrial JC-1 (5,5 6,6-tetracloro- el estado de mórula a partir de un total de 220 oocitos 1,1,3,3–yoduro de tetraetilbenzimidazolicarbocianina, distribuidos en unidades experimentales de 10 oocitos, Molecular Probes) a 1 µg/ml en medio de maduración, derivados de cada tratamiento de maduración (con y sin con incubación a 38.5˚C durante 25 minutos. Los dímeros suero). de JC-1 formados a altos potenciales de membrana (>140mV) fueron observados mediante microscopia de fluorescencia (Carl Zeiss LR66238C) con un filtro de rodamina (máxima emisión 590 nm) BP 450-490, FT 510, 16 Revista CES / Medicina Veterinaria y Zootecnia / Volumen 2 / Número 2 / Julio – Diciembre de 2007 / ISSN 1900-9607
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