LCGC en francais - June 2008 - (Page 11)

Elfakir et al. notamment dans le cas d’échantillons biologiques — il est nécessaire (i) que la séparation chromatographique permette d’exclure suffisamment les composés d’intérêt du volume mort, zone dans laquelle sont élués la plupart des autres constituants de la matrice mais également (ii) qu’elle offre une sélectivité satisfaisante entre les composés d’intérêt, leurs métabolites et leurs homologues tels que certains acides aminés présents conjointement dans la matrice. 7 composés ont ainsi été sélectionnés pour notre étude: 3 herbicides organophosphorés (le glufosinate, le glyphosate et l’éthephon), un résidu du glufosinate (le N-acétyl-glufosinate) et 3 acides aminés de structure proche et présents en quantité importante dans les tissus cérébraux (l’acide glutamique, l’acide aspartique et l’acide -aminobutyrique). Afin de trouver les meilleures conditions chromatographiques en terme de séparation mais aussi en terme de durée d’analyse, 5 colonnes polaires représentatives de la diversité des phases stationnaires HILIC commercialisées, ont été sélectionnées pour notre étude. Ces colonnes ont des propriétés similaires en termes de diamètre des particules et taille de pores (à l’exception de la colonne ZIC HILIC qui a des pores plus gros), mais des surfaces spécifiques et des groupements fonctionnels différents tels que représentés dans le Tableau 1. La colonne Uptisphere Strategy HILIC HSI est constituée de silice vierge ultrapure de haute densité. Selon les conditions de pH de la phase mobile, il faudra prendre en compte la possibilité d’avoir des charges négatives à la surface de la silice du fait de la déprotonation de certains silanols. La colonne Astec NH2 est une phase polymérique aminopropyle qui sera plus ou moins chargée positivement selon le pH de la phase mobile. La phase TSKgel Amide-80 est constituée de groupements carbamoyle non ionisables, greffés à la surface de la silice via une chaîne carbonée aliphatique. C’est une phase qui ne présentera pas de ce fait, d’interactions électrostatiques secondaires avec les solutés ioniques. La colonne Cosmosil HILIC est constituée d’un support de silice greffée avec un groupement triazole qui pourra plus ou moins être chargé positivement en fonction du pH de la phase mobile. La colonne ZIC HILIC est zwitterionique avec des groupements sulfobetaïne greffés de façon covalente à la surface de la silice. Les charges négatives du greffon étant situées à l’extrémité de la chaîne carbonée, seront plus accessibles que les charges positives pour des interactions électrostatiques complémentaires avec les solutés positifs. La Figure 2 présente l’analyse des 7 solutés dans les mêmes conditions de phase mobile [ACN/solution aqueuse d’acétate d’ammonium 40 mM (70:30)] sur les différents supports. Les temps de rétention et les sélectivités dépendent du choix de la phase stationnaire. Quel que soit le support polaire utilisé, c’est toujours le glyphosate qui est élué en dernier et l’ethephon qui est le composé ayant le moins d’interactions avec la phase stationnaire neutre (TSKgel Amide), la phase zwitterionique (ZIC HILIC) et la phase de silice ultra pure (Uptisphere HILIC). La Figure 2 illustre le fait que la séparation en mode HILIC ne se résume pas seulement à un partage des solutés entre la couche d’eau immobilisée à la surface de la phase stationnaire et la phase mobile. Des interactions secondaires sont à considérer pour justifier les différences importantes de rétention et de sélectivité. Dans ces conditions de phase mobile, tous les solutés sont chargés négativement et malgré la présence de sel dans l’éluant (12 mM globalement dans le mélange ACN/eau), il n’est pas possible de les éluer sur la phase aminopropyle (résultats non montrés). Cet effet important d’échange d’ions de la phase amino vis-à-vis des composés acides avait déjà été rapporté précédemment par d’autres auteurs.16,20 Ces résultats confirment www.lcgcenfrancais.fr Figure 2: Analyse des solutés sur 4 colonnes de silice différentes. Phase mobile: ACN/CH3COONH4 40 mM (70:30 v/v). Débit: 0.2 mL min 1 sauf pour la colonne ZIC-HILIC (débit 0.5 mL min 1). Détection: DEDL. Ordre d’élution: 1 GABA, 2 Glu, 3 Asp, 4 Gluf, 5 Eth, 6 NAGluf, 7 Glyph. 5 6 2,3 41 7 1,2,6 5 34 7 5 326 41 7 ZIC HILIC TSKgel Amide-80 UPTISPHERE 1 2,3 4,5 6 7 COSMOSIL 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Figure 3: Effet du pourcentage d’acétonitrile sur la rétention des solutés. Colonne Cosmosil HILIC (150 2 mm). Phase mobile: CH3COONH4 40 mM avec x% d’ACN. Détection: DEDL. Ordre d’élution: 1 GABA, 2 Glu, 3 Asp, 4 Gluf, 5 Eth, 6 NAGluf, 7 Glyph. 1 2,3,4 5 1 6 7 50% ACN 2,3,4 5 1 6 2,3 4,5 6 7 7 60% ACN 70% ACN 0 10 20 30 40 50 que ce type de greffage n’est pas approprié à l’analyse en mode HILIC d’un certain nombre de solutés anioniques. La colonne Cosmosil dont les groupements triazole peuvent également se charger positivement, offre une rétention importante pour les solutés mais contrairement au support aminopropyle, permet leur élution. Les pics chromatographiques sont relativement larges avec des trainées (le glyphosate est élué après 45 min et son pic s’étale sur 5 min). La présence de groupements triazole protonnés à la surface de la silice n’est donc pas favorable à une distribution rapide des solutés entre la phase mobile et la phase stationnaire. Une absence de sélectivité entre les 2 acides aminés Asp et Glu dont la structure ne diffère que par un groupement méthylène, est par ailleurs observée sur ce support. En comparaison, sur la colonne TSKgel Amide-80, colonne non chargée, les rétentions sont beaucoup plus faibles mais c’est la colonne la moins résolutive de toutes les colonnes testées dans ces conditions de phase mobile : les 3 acides aminés Asp, Glu et GABA, sont coélués avec le N-acétylglufosinate à plus de 10 minutes. Les meilleures séparations sont observées avec les colonnes présentant des charges négatives accessibles. Ceci met en évidence qu’en mode HILIC, les interactions secondaires de type électrostatiques qui peuvent avoir lieu entre les solutés ionisés et 11 http://www.lcgcenfrancais.fr

Table des matières de la publication LCGC en francais - June 2008

LCGC en francais - Juin 2008
Table des matières
De l’éditrice
Introduction de l’AfSep
Performances Comparées de Différents Supports Polairesen vue de l’Analyse d’Herbicides Organophosphorés par Chromatograhie d’Interactions Hydrophiles
Problemes Techniques en LC
Connexions en CPG
Corrélation de Cinq Tests Généraux Représentée par ACP et CAH pour la Caractérisation des Phases Stationnaires de CLPI
Caractérisation de Polymères Sous Forme d’Étoiles Chimiques par Électrophorèse Capillaire
Revue de Forum LABO & Biotech 2008
Produits

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